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单细胞组织解离的详细实验方法---外周血中PBMC单细胞悬液制备

发布时间:2022-04-27 03:57:46 来源:澳客比分直播 作者:足彩胜负澳客网     


  原标题:单细胞组织解离的详细实验方法---外周血中PBMC单细胞悬液制备

  从新鲜组织中制备高活性和高质量的单细胞悬液是单细胞转录组测序(scRNA-seq)至关重要的一步,很多单细胞实验折戟在此。常见的问题诸如细胞活性低,细胞背景不干净,细胞碎片多,细胞结团率高等。

  样本制备成为限制单细胞技术广泛应用的一大障碍,也是科研服务公司和广大科研工作者面临的主要难题。

  血液做为循环流动在心血管系统内的红色不透明黏稠液态结缔组织,其主要由血浆和血细胞组成。其中血浆作为运载细胞,营养物质及代谢物的循环液体,主要成分是水(约占90%),其次是细胞蛋白,酶,激素等物质;另外的一部分是血细胞主要包含红细胞,白细胞及血小板三个大类。血液中血细胞的形态,数量,比例与血红蛋白含量称血象,很多疾病都会伴随血象的变化,所以血象检测也做为体外诊断筛查的一种重要形式。在血细胞中存在着参与机体免疫应答,调控相关的一类细胞,我们统称为外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),是外周血中具有单个核的细胞(Mononuclear cell),包含了淋巴细胞和单核细胞(Monocyte)。因外周血中具有单个核的细胞在机体免疫中的重要性,所以单个核的血细胞成为很多科研工作者重点关注和研究的对象。

  根据单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同,红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右,单个核细胞的比重为1.075-1.090,血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液(密度梯度分离液或分层液)作密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,可将各种血细胞与单个核细胞分离。

  1. 样本准备:4 mL全血/每样,正式分离PBMC时使用 2 mL,分两管进行;剩余 2 mL 留做备用。

  2. 在室温平衡血液和Ficoll(样本密度分离液) 30 min;冰上操作以下实验,在15 mL离心管中一次分别加入外周血和1×DPBS(外周血:1×DPBS=1:1)各1mL,移液枪轻轻吹打5次稀释混匀。

  3. 另取一只15 Ml离心管向底部添加 2 mL Ficoll (样本密度分离液),倾斜离心管至30-45 度角,吸取 2 mL 1×DPBS 稀释的血液缓慢加入到 Ficoll (样本密度分离液)上层。

  4. 将15 Ml离心管轻柔转移到高速冷冻离心机中,设置提速加速度设置为9,减速加速度设置为1,离心力700 g,温度20℃离心20 min。

  5. 离心完成后吸取PBMC细胞层(如下图)的细胞,转移至15 Ml离心管中,在离心管中加入6 Ml的1640 (含5% FBS)培养基,使用巴斯吸管轻柔吹打细胞悬液3-5次,重悬细胞。

  6. 红细胞裂解:离心完成后,从离心机中取出离心管,观察离心后的细胞沉淀,如果细胞沉淀中有红色,准备进行红细胞裂解操作(参看裂红步骤I,II,III);收集后的细胞沉淀中没有红色,则可以不进行裂红处理,直接进入下一步。

  红细胞裂解:I.使用宽口抢头弃上清,加入300ul 1640培养基(含5%FBS)轻轻重悬细胞,后加入红细胞裂解液3mL,置于4℃(冰上),裂红计时 3min;如细胞悬液中红细胞较多(如:PBMC) 可以适当延长裂红时间至5min。II.裂红后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机(12℃,300g,5min)中低温离心收集细胞;如若细胞悬液中还有肉眼可见的红细胞沉淀掺杂其中,可重复步骤I,但裂红时间不可超过5min。III.裂红完成后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机(12℃,300 g,5 min)中低温离心收集细胞。

  7. 清洗:离心完成后,从离心机中取出富集了细胞沉淀的离心管,巴斯吸管弃除上清;加入3mL-5mL 的1640(含5%FBS)培养基(注:按照每个米粒大小的细胞沉淀用量3mL的参考标准加入清洗培养基),使用宽口枪头(或巴氏吸管)重悬细胞后, 高速冷冻离心机(12℃,300g,5min)中低温离心收集细胞。

  8. 重复1-2次步骤7对细胞进行清洗去除背景,清洗后的细胞悬液使用1640(含5%FBS)的培养基(注:按照每个米粒大小的细胞沉淀用量150μl的参考标准加入重悬培养基;如遇细胞量极少,甚至肉眼无法看到时可用60μl)重悬,置于冰上待计数上机。

  注意:单细胞测序样本经验提示:离体后的外周血样本需在8小时内进行分离,尽量不要超过12小时,特别是做5’免疫组(VDJ)测序的样本最好在8小时之内分离。血样分离之后的 PBMC 可直接标记上机;也可在几个小时内放置,但标记上机前需做一次清洗,也可以根据课题设计进行细胞冻存,后续复苏后标记上机。不同组织中细胞离体后耐受性不一,所以,细胞是否可以冻存复苏后再进行单细胞测序,需要根据复苏后的活率变化,细胞量变化决定。

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